应用4mug进行GUS报告基因检测

简介：

        Gus基因存在于E.coli等一些细菌基因组内，编码β-葡萄糖苷酸酶(β-glucuronidase，GUS)。β-葡萄糖苷酸酶是一个水解酶，能够水解β-葡萄糖醛酸苷的带有光学活性基因的衍生物，以4-甲基伞形酮-D-葡萄糖醛酸苷(4-methyklumbelliferone-D-glucuronide，4-MUG)为底物，产生的4-甲基伞形酮(4-methylumbelliferone，4-MUB)具有荧光，其检测灵敏度达fmol级。由于绝大多数植物没有检测到葡萄糖苷酸酶的背景活性，因此这个基因被广泛应用于植物基因调控的研究中。
       
         GUS基因作为报告基因的优势：

1.  GUS蛋白在植物细胞中稳定存在，对较高的温度和去污剂有一定的耐受性；
2.  检测方法简单，可定性或定量：使用X-Gal为底物，通过显色反应来观察；使用4-MU为底物，反应以后生成荧光物质，通过相应的荧光检测仪来进行经确定量；
3.  多数植物组织中GUS背景表达低，样品表达能够很好区分。

原理：

检测方法：

详见相关下载文献

1、检测所需器材

• TBS-380微型荧光计
• 10x10mm荧光比色杯
• 微型检测皿适配器，可选
• 硼硅酸盐微型检测皿，可选
• 4-MU，钠盐，MW=198.20 (Sigma, P/N 1508)
• 蒸馏水
• 无水碳酸钠，MW=105.99

2、4-MU溶液的制备

2.1 4-MU贮存液A(1mM)
          19.8mg 4-MU（钠盐），MW=198.20，加蒸馏水至100mL，4°C避光贮存
2.2 4-MU贮存液B(1mM)
          10 µL 4-MU贮存液A，加蒸馏水10mL，4°C避光贮存
2.3 碳酸盐终止缓冲液(0.20M)：
          2.12g无水碳酸钠，MW=105.99，加蒸馏水至100mL

3、 实验方案

3.1 根据操作指导，将裂解细胞和4-MU底物共同孵育。所有样品同一时间内孵育，通常20min。
3.2 向100 µL细胞裂解液中加入1.9mL碳酸盐终止缓冲液，终止反应活性，从而制备检测样品。

4、标准曲线制备
纯化的4-MU能校准细胞培养物或组织中GUS与ß-Gal的活性。产生的标准曲线印证了在一定浓度范围内检测的线性。建议使用新仪器或首次检测时，至少操作本步骤一次。也可以隔几周做一次标准曲线作为定量检测、仪器检测的可靠性和技术一致性的的标准。
4.1 确保TBS-380安装了UV检测模块。如果使用微型检测皿适配器，要保证将其放入检测室里，从前面可以看到“UV”标记。
4.2 向10x10mm比色杯或微型检测皿中加入碳酸盐终止缓冲液制备空白对照。
4.3 向1.9mL碳酸盐终止缓冲液中加入100µL贮存液B（终浓度50nM）；当用微型检测皿时，向45 mL碳酸盐缓冲液中加入5.0mL贮存液B。
4.4 点击[STD VAL]键将标准值调到50，用控制面板上的箭头调高或调低数值。
4.5点击[CAL]键校准，按[ENTER]键继续。按照指导插入空白和稀释液进行测量。按[ENTER]键接受校准值。
4.6读取剩余的系列稀释样品
贮存液A的稀释溶液      10x10mm(容量为2mL)        微型检测皿(容量为100µL)         终浓度(nM)
1:100                                          100µL                                          5.0µL                                  500
1:500                                          100µL                                          5.0µL                                  100
贮存液B                                      100µL                                          5.0µL                                   50
1:5                                              100µL                                          5.0µL                                  10
1:50                                            100µL                                          5.0µL                                  1.0

5、未知样品检测

5.1 用接近样品平均荧光值的稀释液来校准仪器，通常是100nM到500nM（见步骤6.3到6.5）。
5.2 将步骤4.2中的2mL溶液转移到10x10mm比色杯或100µL溶液转移到微型检测皿中，来测量未知样品。插入比色杯，按[READ]键。
5.3 记录结果或通过电子表格界面将数据输入到Excel表格中。

参考文献：

1. 无

*如果您在实验中遇到任何问题, 请与我们的技术人员沟通, 我们将提供最大程度的帮助.
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