萤火虫荧光素酶报告基因发光检测

简介：

        荧光素酶（Luciferase）是自然界中能够产生生物荧光的酶的统称，其中*有代表性的是来自北美萤火虫（Photinus pyralis）体内的荧光素酶。萤火虫荧光素酶属于加氧酶（oxygenase），其发光反应需要O2和Mg2+参与；有辅酶A（CoA）存在时能提高反应效率，增加发光时间。萤火虫荧光素酶无需翻译后修饰，即可表现出荧光素酶活性。因此可将萤火虫荧光素酶的基因插入不同载体，作为报告基因，在细胞中表达。

原理：

检测方法：

以Steady-Glo检测试剂盒为例：
1、所需器材

• Veritas微孔板发光检测仪
• 白色96 孔板
• Steady-Glo 荧光素酶检测试剂盒
• p200 移液器和匹配枪头

2. 实验方案

2.1 试剂制备

a) Steady-Glo 底物：使用所提供的底物，-20°C 下可稳定储存6 个月；4°C 下可储存1 个月。
b) Steady-Glo 缓冲液：使用所提供的缓冲液，储存在25°C 以下的环境条件下。
c) Steady-Glo 试剂：将整瓶Steady-Glo 缓冲液加入Steady-Glo 底物瓶中，颠倒混匀使底物彻底溶解，使用试验当天配制的试剂，或者将配好试剂储存在-20°C 冰箱中，可储存2 周。

注意：在检测时，Steady-Glo 试剂应当维持在室温，因为荧光素酶的活性对温度比较敏感，配制后冻存的试剂应当在低于25°C 条件下溶解，以确保试剂的性能，并且融化后还应充分混匀。一种*简单的方法就是将试剂在室温水浴下溶解。

2.2 仪器安装

a) 双击Veritas 图标运行软件。
b) 从"Welcome to Veritas"对话框中点击"Run Promega Protocol"。
c) 从Promega 预设程序中选择" SteadyGlo "。
d) 在"Main Dialog Box"中点击"Options"，选择需要检测的孔，修改检测次数；同时也可以在"Other Options"中修改检测时间，修改结束点击"Apply Changes"，返回"Main Dialog Box"窗口。
e) 在"Main Dialog Box".中输入个人信息，例如"Experiment", "Operator", "Plate No.", and "Notes"

2.3 样品分析

a) 从培养箱中取出含有培养基的96 孔板。
注意：为了尽可能获得数据重现性。加入试剂前，应室温下平衡细胞培养基。
b) 加入与孔中培养基或者细胞裂解液等量的Steady-Glo™ ®工作液混合后检测萤火虫荧光素酶活性，对于96 孔板，100ul 的细胞培养基中加入100ul 检测试剂。
c) 等待5分钟使细胞充分裂解，开始检测。
d) 将板放入Veritas ™微孔板发光检测仪中，点击“Start”开始检测，检测结束后，所
e) 有需要检测的样品检测结果会以Excel 表格形式显示，如检测中遇到其他问题，请参考问题导读获取更多信息
f) 检测结束就可以通过Excel 进行数据分析。
g) 检测结束后，确保从仪器中取出96 孔板。

参考文献：

1. de Wet, J.R. et al. (1987) Firefly luciferase gene: Structure and expression in mammalian cells. Mol. Cell. Biol. 7, 725–37.
2. DNA delivery from matrix metalloproteinase degradable poly(ethylene glycol) hydrogels to mouse cloned mesenchymal stem cells Yuguo Lei, Tatiana Segura*

*如果您在实验中遇到任何问题, 请与我们的技术人员沟通, 我们将提供最大程度的帮助.
联系电话: 010-82888900转803 电子邮箱: lumflu@yph-bio.com