应用NanoOrange荧光染料进行蛋白质精确定量

简介：

        NanoOrange是一种新型的用于蛋白质精确定量的荧光染料，使用NanoOrange*低可以检测到100ng/ml的蛋白样品，其灵敏度高于Bradford 法 (1 µg/mL)和Lowry 法 (1 µg/mL)等分光光度方法，也高于280-nm吸光光度法(50 µg/mL). 与Bradford 法比较，NanoOrange受不同蛋白影响更小。当NanoOrange处于溶液状态时没有荧光活性，与蛋白作用后，在470-490nm处激发，产生570-590nm的发射光，可以使用荧光计进行检测。

原理：

检测方法：

1.检测所需器材

• TBS-380微型荧光计(P/N 3800-003)
• 10x10 mm比色杯(P/N 7000-957)
• NanoOrange™ 蛋白质定量检测试剂盒 

NanoOrange™ Protein Quantitation Kit包括：
    1.0 mL NanoOrange protein quantitation reagent (500X),
    50 mL NanoOrange protein quantitation diluent (10X),
    0.5 mL 标准牛血清蛋白 (BSA) (2 mg/mL).
    如果使用2 mL 体积的标准比色杯，该试剂盒足够200次测定。

2. 实验方案

2.1试剂制备
用蒸馏水将高浓度NanoOrange™ protein quantitation diluent(10X)稀释10倍，每个测量需要10x10mm比色杯，2.5 mL 1X protein quantitation diluent。实验前，用1X protein quantitation diluent将NanoOrange™ protein quantitation reagent稀释250倍，成为2X NanoOrange工作液。例如，要配备 25 mL 的2X NanoOrange 工作液 (足够 20次测量 ， 10x10 mm 比色杯)，首先要准备 1X protein quantitation diluent ： 混合 2.5 mL 10X protein quantitation diluent 到22.5 mL 蒸馏水中。然后加入100 µL NanoOrange protein quantitation reagent (500X)并混合均匀，成为2x NanoOrange工作液。用铝箔封口放置并避光保存。为了获得*理想的效果，*好在实验前几个小时准备工作液。

2.2蛋白标准曲线

蛋白标准曲线能够将蛋白样品荧光值转换为蛋白浓度。理想状况下，制作蛋白曲线的蛋白质应该和实验中要测定的蛋白质是相同的。然而，牛血清蛋白(BSA)能够为其他蛋白测定提供一个方便的参考标准。NanoOrange™ Protein Quantitation Kit包括 2 mg/mL BSA标准样品，可用来制作标准曲线。为了提供有效的参考标准，制作标准曲线的蛋白溶液中和要检测的蛋白溶液样品中含有杂质水平应相当[A]。蛋白标准曲线不仅能将荧光值转换为蛋白浓度，还能控制荧光值在不同时刻的读书误差，制作蛋白标准曲线应该涵盖所测量的样品系列，例如0 到10 µg/mL，或者其他经过选择的系列范围。
2.2.1配制20 µg/mL 牛血清蛋白（BSA）溶液 （加60 µL标准 BSA到5.94 mL1X蛋白测量稀释液中，如 2.1）。
2.2.2将 20µg/mL BSA 溶液稀释成一系列如表1所示的2X BSA 标准溶液。然后等体积混合2X NanoOrange™工作液和 2X BSA 标准溶液。

2X BSA 标准溶液浓度(µg/mL)      BSA*终的浓度 (µg/mL)
                    20                                               10
                   10                                                 5
                    5                                                 2.5
                    2                                                  1
                   1                                                 0.5
                 0.2                                                0.1
                   0                                                 空白
表 1. 用 BSA制作标准曲线
2.2.3在 90°C 到 96°C之间孵育 10 分钟，避光。孵育后，室温下冷却20分钟，避光。
2.2.4冷却后，转移至少 2.0 mL[B] 样品到聚苯乙烯比色杯中，或者 50µL 样品到小细管中， 按照操作说明书上的操作用 TBS-380微型荧光计检测荧光值。 按仪器上的[ON/OFF]通断电源， 用[A/B]按钮固定到 "Blue" 通道。 按 [STD VAL] 将标准曲线各浓度输入程序， 使用 up 和down 箭头改变浓度值。准备好后， 按[CAL] 按钮开始制作标准曲线，制作过程中TBS-380 Mini-Fluorometer 界面会引导你。
2.2.5 测量余下的标准样品的荧光值，测出的数据用来产生荧光值－蛋白浓度的标准曲线 (图1 和图 2)

2.3 样品分析

2.3.1 用1X蛋白测量稀释液将待测的蛋白样品稀释到希望的浓度(如 3.1)。等体积混合样品和2X NanoOrange工作溶液。 每个样品您可能要进行2或3个平行。高倍稀释能降低杂质对信号的干扰 [A]; 然而，由于很难准确量取，因此应该避免样品体积过少。
2.3.2将样品在 90°C 到 96°C之间避光孵育 10 分钟，然后在室温下避光保存20分钟。3.3.3冷却后，转移2.0 mL[B] 样品到 10x10 mm 比色杯中或者 50 µL样品到小细管中，用与制作标准曲线时相同的方法测定荧光值。(如 3.2.4)。
2.3.4根据3.2.5.中制作的标准曲线将荧光值换算为样品中的蛋白浓度。

参考文献：

1. 无

*如果您在实验中遇到任何问题, 请与我们的技术人员沟通, 我们将提供最大程度的帮助.
联系电话: 010-82888900转803 电子邮箱: lumflu@yph-bio.com