应用Hoechst荧光染料进行DNA精确定量

简介：

        对微量的双链 DNA 进行定量在各种生物学应用中都显得非常重要,例如 cDNA 文库的构建；用于亚克隆的 DNA 片段的纯化；定量 DNA 扩增产物,在药物中DNA 分子残留的测定等 。常规的DNA含量的检测方法是在 260nm（A260）处测其吸光值。这种方法的主要缺点是核苷酸、单链核酸和蛋白质对信号的影响很大，并且还会受到核酸制备过程中污染物的干扰，无法区分 DNA和 RNA，而且这种方法不灵敏（ 5μg/mLdsDNA溶液 A260=0.1）。
        Hoechst 染料是一种非常灵敏的荧光染料。 H33258 选择性的与双链 DNA 结合。在有蛋白的情况下荧光信号并不显著增加,因此可检测和定量低至 10 ng/ml 的 DNA 。

原理：

检测方法：

2. 所需材料
●Modulus单管型多功能检测仪（货号：9200-000或9200-002）
●紫外荧光模块（货号：9200-041）
●微量比色杯（货号：7000-950）和微量适配器（货号：9200-928）或比色杯（货号：7000-959）
●Hoechst 33258 10 mg/ml (分子探针 H3569)
●10XTNE储存缓冲液
●0.45μm的过滤水

3. 考虑因素
3.1 DNA样品中的AT含量会影响到Hoechst 33258-DNA荧光，因此，检测样品时设一对照是非常重要的，小牛胸腺DNA由于是双链、高度聚合并含有大约58%的AT（42% GC）而经常被用作动植物DNA的对照。对于细菌DNA来说，它会有不同的对照，因为不同菌种的AT含量变化较大。
3.2 不同构造的质粒DNA（超螺旋型、螺旋型、环形和、线型）会有不同的Hoechst 33258结合效果。因此，选择一种与样品特征相似的标准品对照也是很重要的。
3.3 在单链基因组DNA上的Hoechst 33258荧光只有在双链基因组DNA上的一半，单链DAN片段的荧光量并不会与单链DAN的浓度成比例地引发荧光。
3.4 用于全细胞DNA抽提的缓冲液对后期的检测没有什么影响。
3.5 少量的去污剂（＜0.01% SDS）对检测也没有什么影响。
3.6 含盐浓度为3M NaCl的DNA抽提样对检测没有影响。为获得较强的荧光，纯化的DNA样品中至少要含有200mM的NaCl，未纯化样品中需含2.0-3.0M的NaCl。对于未纯化样品来讲，较高的盐浓度会将结合在DNA上的蛋白裂解下来，便于染料分子的结合。
3.7 RNA对检测没有影响，因为Hoechst 33258通常并不与RNA结合。来之于RNA的荧光信号通常会低于相同DNA浓度的1%。

4.试剂制备
4.1 Hoechst 33258储存液
        1 mg/ml Hoechst 33258：1ml的Hoechst 33258（10 mg/ml）加9ml的用0.45μm滤膜过滤的蒸馏水稀释而成。
        注：Hoechst 33258可能会致癌和导致基因突变，操作时须带手套、面罩，并且在通风橱内操作。
4.2 10XTNE储存缓冲液
        溶解于800ml蒸馏水中：12.11g Tris碱[Tris（羟甲基）氨基甲烷]，分子量=121.14；3.72g EDTA乙二胺四乙酸，二钠盐，二水合物，分子量=372.20；116.89g 氯化钠，分子量=58.44。用浓盐酸调节溶液PH至7.4，补加蒸馏水定容至1000ml，使用前用0.45μm滤膜过滤，4℃可保存3个月。
        注：PH和氯化钠浓度对于Hoechst试剂和DNA的结合至关重要。
        1倍的TNE:用90ml蒸馏水（0.45μm滤膜过滤）稀释10ml 10倍的TNE。
4.3 准配2倍的染料液用于10-1000 ng/ml的DNA：用100ml的1倍的TNE稀释20µl Hoechst 33258 储存液    (1 mg/ml)，室温放置，现用现配，一旦染料加入千万别再过滤！
4.4 小牛胸腺DNA标准液：准备溶解在1倍TE浓度为1 mg/ml的小牛胸腺DNA储存液，轻击小管充分混匀，4℃可保存3个月。

5. 样品检测
5.1荧光模块的安装
5.1.1关掉多功能机电源开关，根据操作手册插入紫外荧光模块
5.1.2打开电源开关，校准前先预热1min。
5.1.3用于10X10mm比色杯的实验方案
5.1.3.1准备1ml 2000 ng/ml dsDNA标准液校准比色杯。
5.1.3.2以1:1的比例加2倍的染料工作液到2000 ng/ml dsDNA标准液中，终浓度为1000 ng/ml。
5.1.3.3在另外的小管中加入空白对照液：2倍的染料工作液以1:1的比例加入1X TNE缓冲液，*少2ml。
5.1.3.4校准多功能机用1000 ng/ml。
        注：用一个和检测样品浓度相同或相近的标准样优化系统，使检测更精确。例如，若检测样品浓度在300 ng/ml，要用一个500 ng/ml标准DNA样。标准样浓度应该是与检测样浓度相同或超出100 ng/ml。
5.1.3.5保存这次校准以供将来使用（可选）
5.1.3.6向1ml样品的小管中加1ml 2倍的染料液，需要的话，可以用1倍TNE稀释样品。
        注：小管中溶液体积*少需2ml。
5.1.3.7放入多功能机读数前平衡样品和染料混合液5min。
5.1.3.8样品和染料浓度会在多功能机显示屏上显示。
        注：由于染料的加入，*终浓度要小于起始浓度的1/2。另外也要考虑到起始样品的稀释。

5.1.4使用微量比色杯的实验方案
5.1.4.1标准液制备。将1mg/ml 的DNA储存液用1倍TNE稀释到2μg/ml，加相等体积的2倍的染料工作液，而后重复步骤4.4，充分混合。
        注：用一个和检测样品浓度相同或相近的标准样优化系统，使检测更精确。例如，若检测样品浓度在300 ng/ml，要用一个500 ng/ml标准DNA样。标准样浓度应该是与检测样浓度相同或超出100 ng/ml。
5.1.4.2空白对照液制备。在另一只小离心管中加入相同体积的样品缓冲液（通常是1倍TNE）和2倍的染料工作液。
5.1.4.3混合小离心管中加有2倍染料工作液的样品。
        注：在微量比色杯中不要混合检测样、标准样或有染料液的空白对照液。
5.1.4.4取100μl检测样、标准样和空白对照液分别加到微量比色杯中，室温避光静置2-5min。
        注：不要在微量比色杯中引入气泡，它会导致读数错误。
5.1.4.5校准多功能机用1000 ng/ml。
5.1.4.6保存这次校准以供将来使用（可选）
5.1.4.7微量比色杯中样品所测浓度会在多功能机显示屏上显示。
        注：由于染料的加入，*终浓度要小于起始浓度的1/2。另外也要考虑到起始样品的稀释。

参考文献：

1. 无

*如果您在实验中遇到任何问题, 请与我们的技术人员沟通, 我们将提供最大程度的帮助.
联系电话: 010-82888900转803 电子邮箱: lumflu@yph-bio.com